Гепатопротекторные механизмы дигидрокверцетина при острой травме печени, вызванной тетрахлорметаном

Журнал «Питательные вещества» 2019 ноябрь, 11 (11)  Опубликовано 4 ноября 2019 года.

Авторы:

  • Чао-Лин Ян, кандидат наук,  Колледж биофармацевтических и пищевых наук, Китайский медицинский университет, Тайчжун 40402, Тайвань;
  • Ю-Ши Лин, Департамент фармации, Мемориальная больница Цзяи Чан Гун, Цзяи 61363, Тайвань; 
  • Кенг-Фан Лю,  Вэнь-Хуан Пэн, Отдел китайских фармацевтических наук и ресурсов китайской медицины, колледж китайской медицины, Китайский медицинский университет, Тайчжун 40402, Тайвань;
  • Чи-Мин Сюй, Департамент медицинского образования, Мемориальная больница Цзяи Чан Гун, Цзяи 61363, Тайвань;

Абстракт

Цель: изучить гепатопротекторные механизмы таксифолина у мышей с острым повреждением печени, вызванным CCl4

Методы: мышей ICR (Институт исследования рака) перорально предварительно обрабатывали с использованием таксифолина в течение 7 дней подряд, а затем вводили однократные внутрибрюшинные инъекции 0,2% CCl 4 (10 мл/кг массы тела). Затем определяли повреждение печени с использованием анализов сывороточной аланинаминотрансферазы (sALT) и аспартатаминотрансферазы сыворотки (sAST). Кроме того, для изучения гепатозащитных механизмов таксифолина мы определили уровни малонового диальдегида (MDA) и супероксиддисмутазу (SOD), глутатионпероксидазу (GPx) и глутатионредуктазу (GRd). 

Результаты: CCl 4- индуцированное повреждение печени привело к значительному увеличению активности SALT и SAST. Это увеличение было ограничено предварительной обработкой таксифолином. Гистологический анализ также показал, что таксифолин уменьшал диапазон поражений печени у мышей, получавших CCl4, и образование вакуолей, инфильтрация нейтрофилов и некроз заметно уменьшались. Кроме того, активность SOD, GPx и GRd была увеличена, а уровни MDA были снижены после лечения таксифолином. 

Заключение: Гепатопротекторные механизмы таксифолина связаны со снижением уровней MDA, предположительно, из-за повышенной активности антиоксидантных ферментов. Эти результаты показывают, что таксифолин смягчает острое повреждение печени, вызванное CCl4 у мышей, демонстрирующих гепатозащитное действие таксифолина.

Ключевые слова: повреждение печени, таксифолин, антиоксидантные ферменты, четыреххлористый углерод, мыши

Введение

Образование и деградация активных форм кислорода (АФК) у всех аэробных организмов общеизвестны. Кроме того, они опосредуют различные внутриклеточные сигнальные каскады [1]. Избыточное производство АФК вызывает окислительный стресс в организме человека, вызывая повреждение белков, ДНК и липидов и приводя к дегенеративным и патологическим состояниям [2].  Такие факторы окружающей среды, такие как сигаретный дым и некоторые лекарства, могут увеличить активность свободных радикалов в печени. В определенной степени эндогенные антиоксиданты могут поддерживать окислительное равновесие и предотвращать повреждение клеток от избытка АФК в таких условиях [3].

Печень играет важную роль в различных метаболических процессах. Кроме того, повреждение печени приводит к различным тяжелым заболеваниям. Различные токсичные химические вещества и лекарственные средства, а также заражение вирусами, например гепатит, вызывают повреждение печени [4]. 

Метаболизм тетрахлорметана (CCl 4 ) через цитохром P450 приводит к образованию трихлорметильных радикалов [4 , 5], которые быстро реагируют с липидами и белками, в частности, вызывая перекисное окисление липидов клеточных мембран [6]. 

Предыдущие исследования показывают, что антиоксиданты ингибируют образование свободных радикалов и защищают ткани печени от CCl 4.-индуцированное повреждение путем блокирования вредных реакций перекисного окисления липидов. Чтобы использовать эти механизмы, в последние годы были всесторонне исследованы антиоксидантные свойства различных трав и полезных для здоровья продуктов, и были идентифицированы многочисленные активные химические соединения [7].

Таксифолин присутствует в растениях на низком уровне, но был идентифицирован как биофлавоноидный псевдовитамин P. Таксифолин выделен из растений - лиственницы, таких как лиственница и пихта Дугласа, в которых он присутствует на 2–3%.

Таксифолин, по сообщениям, продлевает жизнь на 40% и 37% у мышей с лейкемией [8]. Сильная антибактериальная активность была также продемонстрирована в отношении золотистого стафилококка кишечной палочки шигеллы и сальмонеллезного тифа . Более того, биологическая активность таксифолина связана со снижением активности свободных радикалов у людей и связана с омолаживающим и противоопухолевым эффектами и ингибированием цитопатических эффектов [9]

Хотя лиственница традиционно использовалась для лечения заболеваний печени, соответствующие механизмы еще не были научно подтверждены. Поэтому мы исследовали гепатозащитную антиоксидантную активность таксифолина в CCl 4 - индуцированном остром повреждении печени у мышей. С этой целью мы контролировали повреждение печени в соответствии с уровнями сывороточной аланинаминотрансферазы (sALT) и аспартатаминотрансферазы сыворотки (sAST)[10]. Гистопатологические изменения также наблюдались при биопсии печени, и уровни малонового диальдегида (MDA) определялись наряду с антиоксидантными ферментами супероксиддисмутазой (SOD), глутатионпероксидазой (GPx) и активностями глутатионредуктазы (GRd) [11].

Материалы и методы

Животные

В исследовании использовали самцов мышей ICR (20-25 г), приобретенных в BioLasco Charles River Technology (Тайбэй, Тайвань). Животных выращивали в помещении с контролируемой температурой в Центре животных Китайского медицинского университета при 22 ± 1 ° C (относительная влажность: 55% ± 5%; цикл света и темноты: 12 ч света/12 ч темноты) в течение, по меньшей мере, одна неделя. Мышам давали пищу и чистую воду ad libitum. Все испытания на животных проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Кроме того, Комитет по исследованиям на животных при Китайском медицинском университете утвердил протокол эксперимента (IACUC 2018–249).

CCl 4 -индуцированная гепатотоксичность

Мыши были случайным образом разделены на 6 групп (n = 10). Мышам в контрольной и CCl 4 группах перорально вводили дистиллированную воду, а мышам в группе таксифолина перорально вводили таксифолин в дозе 100, 150 и 200 мг/кг в течение 7 дней подряд. Кроме того, через 1 час после последней предварительной обработки CCl 4 внутрибрюшинно (ip) инъецировали всем мышам, кроме контрольной группы, которые получали эквивалентные объемы оливкового масла (ip). Мышей умерщвляли под наркозом через 24 ч после CCl 4инъекции, и кровь собирали с последующим центрифугированием при 3000 об/мин (Beckman GS-6R, Германия) при 4°С в течение 30 минут для отделения сыворотки. Впоследствии активности sALT и sAST измеряли с помощью спектрофотометрических диагностических наборов (Roche, Германия). Удаление тканей печени проводили для гистологических анализов, анализов MDA и измерений антиоксидантной ферментативной активности.

Гистологический анализ

Свежие ткани печени из тех же долей собирали, обрезали до толщины около 2 мм и затем фиксировали в 10% забуференном растворе формальдегида. Фиксированные ткани разрезали на срезы по 2 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) с последующим исследованием под световым микроскопом (Olympus, Yuan Li Instrument Co., Ltd., Taichung Branch.).

MDA

Уровни МДА определяли методом реагирующего вещества тиобарбитуровой кислоты. Абсорбцию определяли при 532 нм, а уровни МДА выражали в виде мкмоль/мг белка [12].

Измерение активности антиоксидантного фермента

Активность СОД (супероксиддисмутазы) определяли как процедуру, описанную Мисрой и Фридовичем [13]. Поглощение измеряли при 480 нм в течение 4 мин; одна единица активности СОД была выражена как количество фермента, необходимое для ингибирования окисления адреналина на 50%.

Активность GPx была определена как протокол Флоэ и Гюнцлером [14]. Поглощение измеряли при 340 нм в течение 180с, и молярный коэффициент экстинкции 6,22 × 10 -3 использовали для расчета активности фермента. В этих экспериментах одна единица активности определяется как та, которая необходима для окисления НАДФН со скоростью 1 мМ/мин/мг белка.

Согласно методу Карлберга и Маннервика [15], в котором поглощение измеряют при 340 нм в течение 3 мин, а для расчета концентраций продукта используют молярный коэффициент экстинкции 6,22 × 10 -3 , определяют активность GRd. В этих анализах одна единица активности определяется как та, которая необходима для окисления NADPH со скоростью 1 мМ / мин / мг белка.

Статистический анализ

Средство ± стандартные ошибки среднего (SEM) используются для представления данных. Программное обеспечение SPSS использовалось для проведения статистического анализа. Односторонний ANOVA с последующими тестами Тьюки-Крамера (метод Крамера) был использован для выявления значительных различий. Количественный анализ гистологических данных был выполнен с использованием непараметрических критериев Крускала-Уоллиса с последующим U-тестом Манна-Уитни. р <0,05 считали статистически значимым.

Результаты

CCl 4 - индуцированная острая травма печени

Гепатопротекторные эффекты таксифолина у мышей с CCl 4-индуцированным повреждением печени представлены на рисунке 1 (A, B). Обработка CCl 4 значительно увеличивала активность ферментов ALT, AST. Однако предварительная обработка таксифолином (200 мг/кг) значительно снижала повышенную активность печеночных ферментов, индуцированных CCl 4 у мышей.

 

Страница 2. Читать далее